Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

[admin]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

,,Grigore T. Popa" - IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

DETERMINAREA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE DIN

MIEREA DE ALBINE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Coordonator ştiinţific,

Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Doctorand,

Popa (Morariu) Ionela Daniela

IAŞI, 2013



Decizia Rectorului U.M.F. "Grigore. T. Popa" - Iaşi de numire a Comisiei de Doctorat nr. 5041/19.03.2013


Data susţinerii publice a tezei de Doctorat: 11.04.2013
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa" - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine




3








CUPRINS



INTRODUCERE

.................................................. ............................................5



Motivaţia cercetării........................................ .......................................7


Obiective......................................... .................................................. ....8


PARTEA GENERALĂ




.................................................. ................................10





CAPITOLUL I




.................................................. ..............................................10





ALBINA - MORFOLOGIE, FIZIOLOGIE, PATOLOGIE




......................10



I.1. Albina............................................ ................................................10


I.2. Bolile albinelor......................................... ....................................13


I.2.1. Bolile contagioase....................................... .................14


I.2.1.1. Bolile virotice.......................................... .....14


I.2.1.2. Bolile bacteriene........................................ ...15


I.2.1.3. Boli parazitare........................................ .......16


I.2.1.4. Boli micotice.......................................... .......18


I.2.2. Bolile necontagioase..................................... ................19


I.3. Substanţe chimioterapice utilizate în apicultură pentru prevenirea şi tratarea bolilor albinelor......................................... ......................................19


I.3.1. Antibiotice....................................... .............................19


I.3.2. Alte chimioterapice antimicrobiene..............................21


CAPITOLUL II




.................................................. ............................................24





MIEREA DE ALBINE - ASPECTE GENERALE




.....................................24



II.1. Istoric........................................... ................................................24


II.2. Producerea mierii............................................ .............................25


II.3. Tipuri de miere............................................. ...............................27


II.4. Proprietăţile mierii............................................ ...........................27


II.4.1. Proprietăţile senzoriale........................................ ........27


II.4.2.Proprietăţile fizico-chimice ale mierii..........................30


II.5. Mierea în apiterapie........................................ .............................33


II.6. Mierea în circuitul economic.......................................... .............33


II.7. Legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine............................................ .................................................. ..................34

CAPITOLUL III
.................................................. ..........................................38

PREZENŢA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE (CHIMIOTERAPICE ANTIMICROBIENE) ÎN MIEREA DE ALBINE
.................................................. .................................................. .......38

III.1. Surse de poluare a mierii............................................ ................38

III.1.1. Poluarea datorată unor factori de mediu....................38

III.1.2. Poluarea datorată practicilor apicole..........................38

III.2. Metode de determinare a reziduurilor medicamentoase în miere............................................. .................................................. ..................39

III.2.1.Metodele de screening......................................... .......40

III.2.1.1. Clasificarea după principiul de detecţie.......................................... .................................................. .................40

III.2.1.2. Clasificarea după gradul de cuantificare...................................... .................................................. ...............40

III.2.2. Metodele confirmatorii..................................... .........42

III.3. Reziduuri medicamentoase în produse apicole..........................44

PARTEA EXPERIMENTALĂ
.................................................. ...................52

CAPITOLUL IV
.................................................. ...........................................52

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE ALBINE
.................................................. .................................................. .......52

IV.1. Introducere....................................... ..........................................52

IV.1.1. Corelaţii între structura chimică şi activitatea antimicrobiană.................................... .................................................. ............53

IV.1.2. Mecanismul de acţiune al sulfonamidelor.................................... .................................................. ............53

IV.1.3. Provenienţa reziduurilor de sulfonamide în miere............................................. .................................................. ..................56

IV.2. Obiective......................................... ...........................................57 IV.3. Principiul metodei........................................... ...........................57 IV.3.1.Tehnologia Panelurilor Biocip....................................57

IV.3.2. Biocipul.......................................... ............................57

IV.3.3. Detecţia.......................................... ............................58

IV.4. Material şi metodă............................................ ..........................60

IV.5. Validarea metodei........................................... ...........................63

IV.5.1. Liniaritatea metodei........................................... ........68


IV.5.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)............................................ .................................................. .................71


IV.5.3. Specificitatea şi selectivitatea.................................... 72


IV.5.4. Precizia şi acurateţea........................................ ..........73


IV.5.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie (CCβ)............................................. .................................................. .................75


IV.5.6. Regăsirea (recuperarea)..................................... ........76 IV.6. Probele de miere............................................. ...........................77


IV.7. Rezultate şi discuţii.......................................... ..........................79


IV.8. Concluzii......................................... ...........................................80


CAPITOLUL V




.................................................. ............................................82





ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE NITROFURANI ŞI CLORAMFENICOL ÎN MIEREA DE ALBINE




.................................................. .................................................. .......82



V.1. Introducere....................................... ...........................................82


V.1.1. Nitrofuranii...................................... ............................82


V.1.2. Cloramfenicolul................................... ........................83


V.2. Obiective......................................... ............................................84


V.3. Material şi metodă............................................ ...........................84


V.4. Validarea metodei........................................... ............................86


V.4.1. Liniaritatea metodei........................................... .........89


V.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)............................................ .................................................. .................91


V.4.3. Specificitatea şi selectivitatea.................................... ..91


V.4.4. Precizia şi acurateţea........................................ ...........92


V.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie (CCβ)............................................. .................................................. .................94


V.4.6. Regăsirea (recuperarea)..................................... ..........94


V.5. Probele de miere............................................. .............................96


V.6. Rezultate şi discuţii.......................................... ...........................97


V.7. Concluzii......................................... ..........................................100

CAPITOLUL VI
.................................................. .........................................101

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE ÎN MIEREA DE ALBINE
.................................................. .........................101

VI.1. Introducere....................................... ........................................101

VI.1.1. Chinolonele....................................... .......................101

VI.1.2. Cefalosporine (ceftiofur)....................................... ...102

VI.1.3. Amfenicol (fluorfenicol).................................... ......103

VI.1.4. Aminoglicozide (Streptomicina)..............................104

VI.1.5. Macrolide (tilozină)........................................ .........104

VI.1.6. Tetracicline...................................... ........................105 VI.2. Obiective......................................... .........................................106

VI. 3. Material şi metodă............................................ .......................106

VI.4. Validarea metodei........................................... .........................108

VI.4.1. Liniaritatea metodei........................................... ......111

VI.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)............................................ .................................................. ...............113

VI.4.3. Specificitatea şi selectivitatea..................................11 4

VI.4.4. Precizia şi acurateţea........................................ ........115

VI.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie (CCβ)............................................. .................................................. ...............117

VI.4.6. Regăsirea (recuperarea)..................................... ......117

VI.5. Probele de miere............................................. .........................119

VI.6. Rezultate şi discuţii.......................................... ........................120 VI.7. Concluzii......................................... .........................................124

CAPITOLUL VII
.................................................. .......................................125

STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENŢEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR
.................................................. ...........125

VII.1. Introducere....................................... .......................................125 VII.2. Obiectivele cercetării........................................ ......................130

VII.3. Protocol experimental...................................... .......................130

VII.4. Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare de miere conţinând sulfonamide....................................... ..................................131

VII.4.1. Material şi metodă............................................ ......131

VII.4.2. Prelucrarea şi interpretarea statistică......................138

[admin]

VII.4.3. Rezultate......................................... ........................141

VII. 4.3.1. Analiza comparativă a rezultatelor parametrilor analizaţi......................................... .............................................141

VII.4.3.2. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor implicate în reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a eozinofilelor..................................... .................................................. ............157

VII.4.4. Discuţii.......................................... .........................172

VII.4.5. Concluzii......................................... ........................176

VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani după administrare de miere conţinând reziduuri de sulfonamide....................................... .................................................. ...........177

VII.5.1 Material şi metodă............................................ .......177 VII.5.2. Rezultate......................................... ........................184

VII.5.3. Discuţii.......................................... .........................201

VII.5.4. Concluzii......................................... ........................203

CAPITOLUL VIII
.................................................. ......................................205

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE
.................................................. .........205

VIII.1. Concluzii generale.......................................... .......................205

VIII.2. Contribuţii originale......................................... .....................208

VIII.3. Perspective de cercetare......................................... ...............209

BIBLIOGRAFIE
.................................................. ........................................210

AVIZ COMISIA DE ETICĂ A CERCETĂRII
........................................224

AVIZ LABORATOR
.................................................. .................................225

LISTA INDICATORILOR REALIZAŢI DIN PROIECT

......................226



Teza de doctorat cuprinde



:




•

209 pagini (partea generală: 50 pagini, contribuţii personale: 159 pagini)




•

73 tabele




•

144 figuri




•

267 referinţe bibliografice




•

Aviz Comisia de Etica Cercetării




•

Aviz laborator




•

Lista indicatorilor realizaţi din proiect




•

3 Articole ştiinţifice -1 B+; 2 ISI





În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins, tabele, figuri şi referinţe bibliografice.


Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide, nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere.



Această cercetare a fost sus
ținută de proiectul POSDRU/88/1.5/S/63117 „Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi în Aria Europeanã a Cercetãrii".

INTRODUCERE






Mierea este principalul produs apicol, apreciat atât pentru însuşirile sale nutritive, cât şi pentru efectele sale terapeutice; a fost prima substanţă dulce folosită în hrana omului, fiind precursoarea zahărului din trestie sau din sfeclă.


Tendinţa actuală spre consum şi necesitatea îndeplinirii tuturor cerinţelor de calitate pentru produsele alimentare, în care se încadrează mierea şi celelalte produse apicole, determină şi la noi în ţară stabilirea unor standarde de calitate şi metode performante de analiză acceptate de Uniunea Europeană (UE).


O condiţie esenţială pe care trebuie să o îndeplinească alimentele este ca ele să nu conţină substanţe nocive pentru consumatori. Prezenţa substanţelor nocive în alimente i-a preocupat şi îngrijorat de mulţi ani pe specialişti, această problemă căpătând în ultimele decenii o nouă dimensiune datorită poluării crescânde a mediului ambiant, precum şi prin folosirea necontrolată a unor substanţe chimice în scopul optimizării calităţii lor.


În ultima perioadă, o nouă clasă de poluanţi ai alimentelor au intrat în atenţia oamenilor de ştiinţă şi anume reziduurile de produse farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor domestice, incluzând antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante, chimioterapice etc., sunt reţinute ca şi reziduuri în diferite produse. Mai mult, există tendinţa de a nu percepe medicamentele ca un factor poluant, cu toate că există o mare probabilitate ca acestea să se transfere ca atare sau ca metaboliţi în produsele alimentare de origine animală (Hughes, Heritage, 2004).


Asigurarea integrităţii lanţului alimentar şi protejarea sănătăţii consumatorilor devine astfel o necesitate.


Standardele de calitate a mierii în UE restricţionează sever intrarea mierii în oricare din statele europene. Când vorbim de calitatea mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea unei tehnici apicole corecte, dar şi la absenţa reziduurilor medicamentoase.


Reglementările comunitare admit utilizarea mai multor clase de medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani, chinolone) pentru tratarea bolilor la albine şi nu permit prezenţa reziduurilor medicamentoase în miere.

Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate şi determinate deoarece prin alimentaţie pot deveni un factor de risc pentru sănătatea publică. Se impune atât identificarea principiului activ medicamentos cât şi al metaboliţilor lor responsabili în unele cazuri de efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M
et al.,2008).

Reglementările UE cu privire la calitatea produselor apicole relevă necesitatea dezvoltării şi implementării unor metode de determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate pentru identificarea şi dozarea cantitativă a reziduurilor medicamentoase.

Dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodele analitice în vederea monitorizării nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigură punerea pe piaţă a produselor alimentare sigure.

Lucrarea de faţă prezintă rezultatele privind determinarea reziduurilor medicamentoase (antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de albine folosind o metodă nouă de determinare şi anume tehnologia Biocip.

Obiective

Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate, în vederea identificării şi dozării cantitative a reziduurilor medicamentoase din mierea de albine.

Studiul a fost iniţiat în vederea realizării următoarelor obiective:


Validarea metodei de determinare simultanăa 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analizăcu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) ş aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.

Validarea metodei de determinare simultană a 4 nitrofurani şi a cloramfenicolului utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.


Validarea metodei de determinare simultanăa chinolonelor, cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol), aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina), tetraciclinelor utilizând tehnologia Biocip ş aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.


Evidenţerea răpunsului imun la şbolani prin determinarea citokinelor, eozinofilelor ş a imunoglobulinei E (IgE), dupăadministrarea de miere conţnând sulfonamide.


Studiu experimental al influenţi reziduurilor medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri biochimici ş hematologici la animale de laborator (şbolani).

Partea generală
a tezei de doctorat este structuratăîn 3 capitole:

Capitolul I
expune date din literatura de specialitate privind morfologia, fiziologia ş patologia albinei.

Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul
Hymenoptera, familia Apidae, genul Apis. Albina meliferăprezintă3 grupe geografice mari ş anume: albina meliferăafricană albina meliferădin orientul apropiat ş albina meliferăeuropeană care datorităînsuşrilor sale superioare s-a răpândit pe tot globul.

Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai periculoase ş se trateazăcu chimioterapice antimicrobiene.

Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene ş micotice.



Bolile bacteriene cele mai răspândite sunt Loca americana, Loca europeana, septicemia şi paratifoza.


Loca americana este de departe cea mai virulentă boală de puiet cunoscută la albinele melifere fiind rezultatul infectării cu bacteria sporulată
Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch, 2006). Este foarte contagioasă şi dacă nu este tratată la timp şi corespunzător poate conduce la dispariţia întregii colonii, răspândindu-se şi la alte stupine (Williams, 2000).



Loca europeana este mai puţin gravă decât Loca americana, deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariţia ei nu sporulează, iar sporii speciilor sporogene au o rezistenţă mai scăzută faţă de acţiunea agenţilor fizici sau chimici.


Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza şi senotainioza.


Compuşii utilizaţi în tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor sunt: antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, chinolone, nitrofurani).


Capitolul II




este destinat principalului produs apicol, mierea de albine şi debutează cu o prezentare succintă a importanţei şi semnificaţiei mierii la multe civilizaţii antice, ce au înflorit şi decăzut pe parcursul timpului.



Acest capitol continuă cu prezentarea modului de producere a mierii, precum şi a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia.


Proprietăţile mierii sunt prezentate în două secţiuni distincte şi anume: proprietăţi senzoriale şi proprietăţi fizico-chimice.


Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziţia ei chimică, de modul de extracţie din faguri, de modul de condiţionare, de timpul şi condiţiile de păstrare.


Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile. Mierea conţine cantităţi reduse de substanţe azotoase reprezentate în principal de enzime. Substanţele minerale sunt moderat reprezentate în mierea de flori şi relativ abundente în cea de mană. Mierea conţine o
gamă largă de acizi organici, lipide, pigmenţi, enzime, uleiuri eterice, substanţe cu acţiune antimicrobiană, vitamine. De conţinutul în zaharuri depind în mare măsură calităţile fizice ale mierii şi anume: vâscozitatea, higroscopicitatea şi capacitatea de cristalizare.



Acţiunea terapeutică a mierii de albine se exercită atât asupra aparatului digestiv (stomac, intestin), cât şi asupra ficatului şi căilor biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului nervos (Andriţoiu, 2006;

Grigore, 2008).



Spre finalul capitolului II sunt atinse câteva aspecte legate de circuitul economic al mierii în Europa şi la nivel mondial. Dacă în Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, România a urcat în primii 20 producători de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu cele 300 mii tone obţinute anual. Printre marii producători ai lumii se mai numără ţări precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia şi Ucraina, având fiecare producţii în jur de 80 mii tone pe an.


Un aspect important prezentat în acest capitol îl reprezintă legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine.


În Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele de origine animalã, legislaţia europeană defineşte prin termenul de reziduuri toate substanţele farmacologic active: principii active, excipienţi sau produse de degradare, precum şi metaboliţii acestora, care se regăsesc în produsele alimentare obţinute de la animalele cărora li s-au administrat medicamente de uz veterinar.


Controlul şi monitorizarea reziduurilor medicamentoase în alimentele de origine animală este reglementată de către Uniunea Europeană. Obiectivul principal al legislaţiei este de a elabora norme pe baza cărora să se detecteze utilizarea ilegală de substanţe în produsele de origine animală, utilizarea abuzivă a medicamentelor de uz veterinar şi de a asigura punerea în aplicare a acţiunilor adecvate în vederea minimizării reapariţiei tuturor acestor reziduuri în alimentele de origine animală.


Termenul de ,,limita maximă de reziduuri’’ (LMR) poate fi definit drept concentraţia maximă de reziduu, care rezultă din utilizarea
unui medicament veterinar, exprimată în μg/kg, care este permisă de lege sau este recunoscută ca acceptabilă în sau pe un aliment. LMR se exprimă pe tipul şi cantitatea de reziduuri, considerat a fi fără risc toxicologic pentru sănătatea umană.


Un rol important în determinarea reziduurilor medicamentoase din miere îl au sensibilitatea şi precizia metodei de detecţie. Deoarece sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitică să garanteze o limită de detecţie cât mai scăzută.


Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere în aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte performanţa metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. Această decizie prevede criterii de performanţă şi alte cerinţe pentru metodele de analiză care urmează să fie utilizate în testarea probelor de miere, pentru a asigura calitatea şi compararea rezultatelor analitice generate de către laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor.


Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a Deciziei 2002/657/CE) este necesar să se prevadă stabilirea progresivă a limitelor de performan
ță minime necesare (LPMN) aplicabile metodelor de analiză care trebuie utilizate pentru substanțele pentru care nu s-a definit nici o limită autorizată şi, în special, pentru substanțele a căror utilizare nu este autorizată sau este special interzisă în Comunitate în vederea garantării punerii în aplicare armonizate a Directivei 96/23/CE.



Limita de performan

ță minimă necesară (LPMN) reprezintă conținutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puțin detectat și confirmat (limita minimă de detecţie a metodei).



Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN variază în jurul valorii de 10 μg/kg; pentru cloramfenicol această limită este de 0,3 μg/kg, iar pentru nitrofurani de 1 μg/kg (Michaud, 2005).


Capitolul III

prezintă principalele surse de poluare ale produselor apicole care sunt mediul poluant şi substanţele utilizate de apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor.




Activitatea albinelor este influenţată de toate elementele de mediu (sol, vegetaţie, aer şi apă) (Pohl, 2009)

.



Bogdanov (2006) subliniază faptul că pericolul de contaminare a produselor apicole provine într-o mai mare măsură din practicile apicole, decât din mediul înconjurător. Apicultorii trebuie să ia măsuri pentru prevenirea contaminării produselor apicole optând pentru alternative ecologice în controlul bolilor albinelor, prin utilizarea substanţelor naturale netoxice în detrimentul celor sintetice.


La ora actuală, în tratamentul bolilor de albine, apicultorii folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei şi chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana şi boala Loca europeana (Kleespies, 2000)
.



Prezenţa reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din miere este corelată cu tratamentele aplicate albinelor în cazul bolii Loca americana şi/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase cauzate de bacteriile

Paenibacillus larvae subsp. larvae şi respectiv Melissococcus pluton. În tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor, care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet şi rapid stupina, apicultorii utilizează sulfamidele şi unele antibiotice. Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparentă vindecare pentru că bacteria dezvoltă spori foarte rezistenţi care nu sunt distruşi de aceste chimioterapice antimicrobiene şi provoacă reinfectarea. De aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel, pericolul reziduurilor în produsele apicole este mare, coloniile rămân purtătoare de spori, iar pericolul infecţios persistă (Ritter, 2000).



De asemenea, în acest capitol sunt prezentate metodele de determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor Uniunii Europene incluse în Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste metode se împart în metode de screening şi metode confirmatorii.


Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA, testul Charm II şi testul ROSA. În general, rata rezultatelor fals pozitive pentru testul Charm II este destul de ridicată (Reybroeck, 2003; Beaune
et al., 2005).

[admin]

VII.4.3. Rezultate......................................... ........................141

VII. 4.3.1. Analiza comparativă a rezultatelor parametrilor analizaţi......................................... .............................................141

VII.4.3.2. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor implicate în reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a eozinofilelor..................................... .................................................. ............157

VII.4.4. Discuţii.......................................... .........................172

VII.4.5. Concluzii......................................... ........................176

VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani după administrare de miere conţinând reziduuri de sulfonamide....................................... .................................................. ...........177

VII.5.1 Material şi metodă............................................ .......177 VII.5.2. Rezultate......................................... ........................184

VII.5.3. Discuţii.......................................... .........................201

VII.5.4. Concluzii......................................... ........................203

CAPITOLUL VIII
.................................................. ......................................205

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE
.................................................. .........205

VIII.1. Concluzii generale.......................................... .......................205

VIII.2. Contribuţii originale......................................... .....................208

VIII.3. Perspective de cercetare......................................... ...............209

BIBLIOGRAFIE
.................................................. ........................................210

AVIZ COMISIA DE ETICĂ A CERCETĂRII
........................................224

AVIZ LABORATOR
.................................................. .................................225

LISTA INDICATORILOR REALIZAŢI DIN PROIECT

......................226



Teza de doctorat cuprinde



:




•

209 pagini (partea generală: 50 pagini, contribuţii personale: 159 pagini)




•

73 tabele




•

144 figuri




•

267 referinţe bibliografice




•

Aviz Comisia de Etica Cercetării




•

Aviz laborator




•

Lista indicatorilor realizaţi din proiect




•

3 Articole ştiinţifice -1 B+; 2 ISI





În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins, tabele, figuri şi referinţe bibliografice.


Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide, nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere.



Această cercetare a fost sus
ținută de proiectul POSDRU/88/1.5/S/63117 „Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi în Aria Europeanã a Cercetãrii".

INTRODUCERE






Mierea este principalul produs apicol, apreciat atât pentru însuşirile sale nutritive, cât şi pentru efectele sale terapeutice; a fost prima substanţă dulce folosită în hrana omului, fiind precursoarea zahărului din trestie sau din sfeclă.


Tendinţa actuală spre consum şi necesitatea îndeplinirii tuturor cerinţelor de calitate pentru produsele alimentare, în care se încadrează mierea şi celelalte produse apicole, determină şi la noi în ţară stabilirea unor standarde de calitate şi metode performante de analiză acceptate de Uniunea Europeană (UE).


O condiţie esenţială pe care trebuie să o îndeplinească alimentele este ca ele să nu conţină substanţe nocive pentru consumatori. Prezenţa substanţelor nocive în alimente i-a preocupat şi îngrijorat de mulţi ani pe specialişti, această problemă căpătând în ultimele decenii o nouă dimensiune datorită poluării crescânde a mediului ambiant, precum şi prin folosirea necontrolată a unor substanţe chimice în scopul optimizării calităţii lor.


În ultima perioadă, o nouă clasă de poluanţi ai alimentelor au intrat în atenţia oamenilor de ştiinţă şi anume reziduurile de produse farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor domestice, incluzând antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante, chimioterapice etc., sunt reţinute ca şi reziduuri în diferite produse. Mai mult, există tendinţa de a nu percepe medicamentele ca un factor poluant, cu toate că există o mare probabilitate ca acestea să se transfere ca atare sau ca metaboliţi în produsele alimentare de origine animală (Hughes, Heritage, 2004).


Asigurarea integrităţii lanţului alimentar şi protejarea sănătăţii consumatorilor devine astfel o necesitate.


Standardele de calitate a mierii în UE restricţionează sever intrarea mierii în oricare din statele europene. Când vorbim de calitatea mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea unei tehnici apicole corecte, dar şi la absenţa reziduurilor medicamentoase.


Reglementările comunitare admit utilizarea mai multor clase de medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani, chinolone) pentru tratarea bolilor la albine şi nu permit prezenţa reziduurilor medicamentoase în miere.

Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate şi determinate deoarece prin alimentaţie pot deveni un factor de risc pentru sănătatea publică. Se impune atât identificarea principiului activ medicamentos cât şi al metaboliţilor lor responsabili în unele cazuri de efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M
et al.,2008).

Reglementările UE cu privire la calitatea produselor apicole relevă necesitatea dezvoltării şi implementării unor metode de determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate pentru identificarea şi dozarea cantitativă a reziduurilor medicamentoase.

Dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodele analitice în vederea monitorizării nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigură punerea pe piaţă a produselor alimentare sigure.

Lucrarea de faţă prezintă rezultatele privind determinarea reziduurilor medicamentoase (antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de albine folosind o metodă nouă de determinare şi anume tehnologia Biocip.

Obiective

Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate, în vederea identificării şi dozării cantitative a reziduurilor medicamentoase din mierea de albine.

Studiul a fost iniţiat în vederea realizării următoarelor obiective:


Validarea metodei de determinare simultanăa 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analizăcu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) ş aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.

Validarea metodei de determinare simultană a 4 nitrofurani şi a cloramfenicolului utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.


Validarea metodei de determinare simultanăa chinolonelor, cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol), aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina), tetraciclinelor utilizând tehnologia Biocip ş aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.


Evidenţerea răpunsului imun la şbolani prin determinarea citokinelor, eozinofilelor ş a imunoglobulinei E (IgE), dupăadministrarea de miere conţnând sulfonamide.


Studiu experimental al influenţi reziduurilor medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri biochimici ş hematologici la animale de laborator (şbolani).

Partea generală
a tezei de doctorat este structuratăîn 3 capitole:

Capitolul I
expune date din literatura de specialitate privind morfologia, fiziologia ş patologia albinei.

Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul
Hymenoptera, familia Apidae, genul Apis. Albina meliferăprezintă3 grupe geografice mari ş anume: albina meliferăafricană albina meliferădin orientul apropiat ş albina meliferăeuropeană care datorităînsuşrilor sale superioare s-a răpândit pe tot globul.

Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai periculoase ş se trateazăcu chimioterapice antimicrobiene.

Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene ş micotice.



Bolile bacteriene cele mai răspândite sunt Loca americana, Loca europeana, septicemia şi paratifoza.


Loca americana este de departe cea mai virulentă boală de puiet cunoscută la albinele melifere fiind rezultatul infectării cu bacteria sporulată
Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch, 2006). Este foarte contagioasă şi dacă nu este tratată la timp şi corespunzător poate conduce la dispariţia întregii colonii, răspândindu-se şi la alte stupine (Williams, 2000).



Loca europeana este mai puţin gravă decât Loca americana, deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariţia ei nu sporulează, iar sporii speciilor sporogene au o rezistenţă mai scăzută faţă de acţiunea agenţilor fizici sau chimici.


Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza şi senotainioza.


Compuşii utilizaţi în tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor sunt: antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, chinolone, nitrofurani).


Capitolul II




este destinat principalului produs apicol, mierea de albine şi debutează cu o prezentare succintă a importanţei şi semnificaţiei mierii la multe civilizaţii antice, ce au înflorit şi decăzut pe parcursul timpului.



Acest capitol continuă cu prezentarea modului de producere a mierii, precum şi a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia.


Proprietăţile mierii sunt prezentate în două secţiuni distincte şi anume: proprietăţi senzoriale şi proprietăţi fizico-chimice.


Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziţia ei chimică, de modul de extracţie din faguri, de modul de condiţionare, de timpul şi condiţiile de păstrare.


Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile. Mierea conţine cantităţi reduse de substanţe azotoase reprezentate în principal de enzime. Substanţele minerale sunt moderat reprezentate în mierea de flori şi relativ abundente în cea de mană. Mierea conţine o
gamă largă de acizi organici, lipide, pigmenţi, enzime, uleiuri eterice, substanţe cu acţiune antimicrobiană, vitamine. De conţinutul în zaharuri depind în mare măsură calităţile fizice ale mierii şi anume: vâscozitatea, higroscopicitatea şi capacitatea de cristalizare.



Acţiunea terapeutică a mierii de albine se exercită atât asupra aparatului digestiv (stomac, intestin), cât şi asupra ficatului şi căilor biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului nervos (Andriţoiu, 2006;

Grigore, 2008).



Spre finalul capitolului II sunt atinse câteva aspecte legate de circuitul economic al mierii în Europa şi la nivel mondial. Dacă în Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, România a urcat în primii 20 producători de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu cele 300 mii tone obţinute anual. Printre marii producători ai lumii se mai numără ţări precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia şi Ucraina, având fiecare producţii în jur de 80 mii tone pe an.


Un aspect important prezentat în acest capitol îl reprezintă legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine.


În Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele de origine animalã, legislaţia europeană defineşte prin termenul de reziduuri toate substanţele farmacologic active: principii active, excipienţi sau produse de degradare, precum şi metaboliţii acestora, care se regăsesc în produsele alimentare obţinute de la animalele cărora li s-au administrat medicamente de uz veterinar.


Controlul şi monitorizarea reziduurilor medicamentoase în alimentele de origine animală este reglementată de către Uniunea Europeană. Obiectivul principal al legislaţiei este de a elabora norme pe baza cărora să se detecteze utilizarea ilegală de substanţe în produsele de origine animală, utilizarea abuzivă a medicamentelor de uz veterinar şi de a asigura punerea în aplicare a acţiunilor adecvate în vederea minimizării reapariţiei tuturor acestor reziduuri în alimentele de origine animală.


Termenul de ,,limita maximă de reziduuri’’ (LMR) poate fi definit drept concentraţia maximă de reziduu, care rezultă din utilizarea
unui medicament veterinar, exprimată în μg/kg, care este permisă de lege sau este recunoscută ca acceptabilă în sau pe un aliment. LMR se exprimă pe tipul şi cantitatea de reziduuri, considerat a fi fără risc toxicologic pentru sănătatea umană.


Un rol important în determinarea reziduurilor medicamentoase din miere îl au sensibilitatea şi precizia metodei de detecţie. Deoarece sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitică să garanteze o limită de detecţie cât mai scăzută.


Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere în aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte performanţa metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. Această decizie prevede criterii de performanţă şi alte cerinţe pentru metodele de analiză care urmează să fie utilizate în testarea probelor de miere, pentru a asigura calitatea şi compararea rezultatelor analitice generate de către laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor.


Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a Deciziei 2002/657/CE) este necesar să se prevadă stabilirea progresivă a limitelor de performan
ță minime necesare (LPMN) aplicabile metodelor de analiză care trebuie utilizate pentru substanțele pentru care nu s-a definit nici o limită autorizată şi, în special, pentru substanțele a căror utilizare nu este autorizată sau este special interzisă în Comunitate în vederea garantării punerii în aplicare armonizate a Directivei 96/23/CE.



Limita de performan

ță minimă necesară (LPMN) reprezintă conținutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puțin detectat și confirmat (limita minimă de detecţie a metodei).



Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN variază în jurul valorii de 10 μg/kg; pentru cloramfenicol această limită este de 0,3 μg/kg, iar pentru nitrofurani de 1 μg/kg (Michaud, 2005).


Capitolul III

prezintă principalele surse de poluare ale produselor apicole care sunt mediul poluant şi substanţele utilizate de apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor.




Activitatea albinelor este influenţată de toate elementele de mediu (sol, vegetaţie, aer şi apă) (Pohl, 2009)

.



Bogdanov (2006) subliniază faptul că pericolul de contaminare a produselor apicole provine într-o mai mare măsură din practicile apicole, decât din mediul înconjurător. Apicultorii trebuie să ia măsuri pentru prevenirea contaminării produselor apicole optând pentru alternative ecologice în controlul bolilor albinelor, prin utilizarea substanţelor naturale netoxice în detrimentul celor sintetice.


La ora actuală, în tratamentul bolilor de albine, apicultorii folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei şi chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana şi boala Loca europeana (Kleespies, 2000)
.



Prezenţa reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din miere este corelată cu tratamentele aplicate albinelor în cazul bolii Loca americana şi/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase cauzate de bacteriile

Paenibacillus larvae subsp. larvae şi respectiv Melissococcus pluton. În tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor, care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet şi rapid stupina, apicultorii utilizează sulfamidele şi unele antibiotice. Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparentă vindecare pentru că bacteria dezvoltă spori foarte rezistenţi care nu sunt distruşi de aceste chimioterapice antimicrobiene şi provoacă reinfectarea. De aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel, pericolul reziduurilor în produsele apicole este mare, coloniile rămân purtătoare de spori, iar pericolul infecţios persistă (Ritter, 2000).



De asemenea, în acest capitol sunt prezentate metodele de determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor Uniunii Europene incluse în Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste metode se împart în metode de screening şi metode confirmatorii.


Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA, testul Charm II şi testul ROSA. În general, rata rezultatelor fals pozitive pentru testul Charm II este destul de ridicată (Reybroeck, 2003; Beaune
et al., 2005).

[admin]

Testul ELISA, utilizat cu succes pentru miere, evidenţiază prezenţa antibioticelor în urma reacţiilor imunoenzimatice pentru determinarea anticorpilor şi a antigenelor specifici.

Metoda ELISA se utilizează pentru determinări semicantitative datorită încrucişării reactivităţilor antibioticelor ce aparţin aceluiaşi grup de antibiotice. În prezent, testul ELISA este frecvent înlocuit de testul Charm II (Bogdanov, 2003).

Testul Charm II reprezintă tot o metodă de screening utilizată pentru diferite matrici, cum ar fi carnea şi laptele şi a fost adaptată şi pentru miere. Sunt cunoscute teste Charm II pentru determinarea de chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, antibiotice: tetracicline, antibiotice betalactamice, macrolide, amfenicoli şi aminoglicozide). Un procent cuprins între 0-30% dintre probele depistate pozitive în urma testărilor vor fi confirmate prin alte metode, cum ar fi HPLC sau LC-MS (Kocher,1996; Edder
et al., 1999; Edder, Corvi, 2001).

Un dezavantaj al testului Charm II constă în faptul că acesta permite detectarea întregului grup de antibiotice, nu a fiecărui reprezentant individual fiind astfel inferior altor metode cantitative (Bogdanov, 2003; Quintana-Rizzo
et al., 2005; Bonvehi, Gutierrez, 2009).

Testul ROSA (
Rapid One Step Assay) reprezintă o altă metodă de screening calitativă pentru detectarea reziduurilor medicamentoase din miere. Acesta utilizează o bandă test şi un minim de echipament (un incubator), iar rezultatele se pot citi direct. Testul ROSA este utilizat pentru depistarea penicilinei G şi a unor compuşi β-lactamici (cefalosporine) din miere. Sensibilitatea pentru penicilină este de 20 μg/kg, iar pentru compuşii β-lactamici analizaţi este de 20-200 μg/kg (Legg et al., 2003).

Rezultatele metodelor de screening sunt calitative şi semicantitative, iar probele testate pozitiv se vor confirma prin metode analitice de mare sensibilitate (HPLC, LC) în vederea cuantificării reziduurilor de antibiotice şi chimioterapice antimicrobiene.

Metoda HPLC este cea mai extinsă tehnică cromatografică utilizată pentru analiza antibioticelor (Kanfer
et al
., 1998) în special cea
cuplată cu detector UV (Vinas
et al., 2004), dar prezintă şi unele dezavantaje, precum faptul că fiecare clasă de antibiotice trebuie testată separat.


Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de masă s-a obţinut un instrument de analiză performant, capabil să separe, să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe.


Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE prevede ca toate metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, să fie confirmate prin spectrometrie de masă (Gentili
et al., 2005).


Metoda LC-MS prezintă o siguranţă de detecţie de aproape 100% (Nakazawa
et al., 1999). Metoda a fost dezvoltată pentru sulfonamide şi tetracicline (tetraciclină, oxitetraciclină şi cloroxitetraciclină). Limita de detecţie este între 0,5 - 10 μg/kg, depinzând de substanţă. Metoda a continuat să se extindă şi pentru cloramfenicol şi streptomicină. Obiectivul principal a fost dezvoltarea metodei LC-MS, capabilă să detecteze toate reziduurile de antibiotice din miere (Bogdanov, 2003).


În ultima perioadă s-au efectuat numeroase studii privind depistarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine utilizând numeroase metode de determinare cu diferite limite de detecţie şi cuantificare. Stadiul actual al cunoaşterii privind utilizarea acestor metode de determinare pentru probele de miere este prezentat în cadrul acestui capitol al tezei de doctorat.
Partea experimentală



a tezei de doctorat este structurată în 5 capitole care urmăresc îndeplinirea sistematică a obiectivelor propuse în cercetarea doctorală.




Capitolul IV - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE ALBINE


Scopul cercetãrii






Cercetarea prezentă a avut drept scop validarea unei metode de determinare simultană a 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analiză cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) în vederea evaluãrii conţinutului acestora în probe de miere disponibile pe piaţa comercială din România.



Introducere






La ora actuală, în medicina veterinară, sulfonamidele sunt printre cele mai folosite substanţe medicamentoase, datorită faptului că au un preţ scăzut (comparativ cu antibioticele), un spectru antibacterian larg şi o eficacitate terapeutică apreciabilă în unele boli infecţioase.


Sulfonamidele sunt folosite în apicultură pentru a trata trei boli ale albinelor şi anume, boala Loca americana, boala Loca europeana şi nosemoza (Reybroeck
et al., 2010).




Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfachinoxalina şi sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide în medicina veterinară, inclusiv în apicultură. Dacă perioada dintre tratamentul albinelor şi recoltarea mierii nu este respectată, aceasta poate fi contaminată cu reziduuri din aceste substanţe. Interesul pentru detectarea acestor reziduuri este de mare actualitate.


Avertizări recente ale Uniunii Europene în legătură cu prezenţa sulfonamidelor în miere au condus la intensificarea supravegherii reziduurilor medicamentoase şi necesitatea dezvoltării de metode sensibile şi rapide de screening ale reziduurilor acestor substanţe în acest produs alimentar deosebit de apreciat de consumatori (Thompson, Noot, 2005).


Material şi metodă

Metoda Biocip aplicată se încadrează, conform criteriilor de clasificare a metodelor de determinare a reziduurilor din miere, în categoria metodelor de screening.

Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence Investigator produs de firma
Randox, UK. Acest sistem utilizează principiile imunologice de bază: metoda competitivă tip sandwich, bazată pe captură de anticorpi. Metoda de detecţie este chemiluminescenţa.

Reactivii sunt livraţi de producătorul aparatului şi includ:


Antimicrobial Array I - kit (cod de catalog EV3523, Randox Laboratories, UK).


Control: Sulphonamide Multianalit Control (cod de catalog AMC5004, Randox Laboratories, UK).

Validarea metodei

Metoda de validare ş procedura de analizăa produselor apicole s-a realizat în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele analitice ale FDA, ghidurile de validare pentru reziduuri medicamentoase, ghidurilor pentru implementarea Deciziei Comisiei 2002/657/CE, ghidurilor de validarea a metodelor de screening pentru reziduurile de medicamente veterinare ş Procedurile Standard de Operare ale Laboratorului S.C.Investigaţi Medicale Praxis S.R.L. Iaş.

Parametrii de validare evaluaţ au fost urmăorii: calibrarea (liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea ş selectivitatea; precizia (intermediarăş reproductibilitate) ş acurateţa; limita de detecţe, regăirea (recuperarea) (tabel IV.2 - IV.5).

Limita de decizie obţnutăpentru sulfonamidele determinate s-a încadrat între valorile 0,54 μ/kg ş 5,14 μ/kg. Capabilitatea de detecţe obţnutăpentru sulfonamidele determinate s-a încadrat între valorile 0,79 μ/kg ş 7,99 μ/kg conform tabel IV.3, tabel IV.5 ş fig. IV.32.

[admin]

Tabelul IV.2 : Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe) Parametrii de validare																		ANALIT
SZ					SDM							SQ						SMT						ST						SS
Liniaritate			Interval de calibrare (μg/kg)					0 - 20,00					0 - 20,50				0 - 20,20					0 - 11,20					0 - 21,10					0 - 11,20
Coeficient de corelatie r				0,987					0,982						0,986					0,988						0,991					0,986
Senibilitate			IC 50 (μg/kg)					0,89					1,90				1,60					0,20					0,40					0,60
Precizie şi acurateţe	Aceeaşi serie					Nivel 1				Conc.(μg/kg)				57			51				50				51				59					47
CV (%)				6					7						10					9						5					8
Nivel 2			Conc.(μg/kg)					115					99				89					112					131					113
CV (%)				7					6						9					7						9					5
Nivel 3			Conc.(μg/kg)					164					140				134					170					206					167
CV (%)				6					5						5					7						6					7
Serii diferite		Nivel 1					Conc.(μg/kg)				84					51			54				61					51					36
CV (%)				10					11						10					14						14					11
Nivel 2			Conc.(μg/kg)					171					101				141					101					122					90
CV (%)				12					8						10					7						12					9
Nivel 3			Conc.(μg/kg)					259					160				212					138					207					136
CV (%)				15					10						10					7						11					10

Tabelul IV.3: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie) Parametrii de validare														ANALIT
SZ				SDM				SQ					SMT					ST				SS
Recuperarea	Nivel 1				Conc.(μg/kg)			44			51				49			50			57				46
Recuperare (%)			112				102			98						100			115				92
Nivel 2		Conc.(μg/kg)				113			96			86					112			129				112
Recuperare (%)			113				96			86						112			129				112
Nivel 3		Conc.(μg/kg)				159			138			134					169			204				166
Recuperare (%)			106				92			89						113			136				111
Limita de decizie CCα şi capabilitate de detecţie CC β		Conc. medie (μg/kg)				1,71			2,41			1,23					2,29			0,71				2,01
DS			0,39				0,54			0,11						1,74			0,24				0,30
1,64 x DS			0,64				0,89			0,18						2,85			0,39				0,49
CCα (μg/kg)			2,35				3,30			1,41						5,14			1,10				2,50
CC β (μg/kg)			2,99				4,19			1,59						7,99			1,49				2,99

[admin]

Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe) Parametrii de validare																		ANALIT
SP					SM							SMP						SCP						SMZ						SD
Liniaritate			Interval de calibrare (μg/kg)					0 - 19,40					0 - 2,50				0 - 19,60					0 - 19,60					0 - 11,70					0 - 19,40
Coeficient de corelatie r				0,993					0,985						0,991					0,993						0,996					0,989
Senibilitate			IC 50 (μg/kg)					2,50					0,20				0,80					0,60					0,30					0,60
Precizie şi acurateţe	Aceeaşi serie					Nivel 1				Conc.(μg/kg)				58			50				53				48				68					45
CV (%)				7					7						7					6						5					9
Nivel 2			Conc.(μg/kg)					100					112				129					102					149					101
CV (%)				6					10						6					8						5					8
Nivel 3			Conc.(μg/kg)					140					174				190					149					236					139
CV (%)				7					5						6					5						6					7
Serii diferite		Nivel 1					Conc.(μg/kg)				94					62			58				78					98					38
CV (%)				11					10						9					11						9					11
Nivel 2			Conc.(μg/kg)					192					80				112					124					158					64
CV (%)				13					14						8					11						8					10
Nivel 3			Conc.(μg/kg)					275					156				175					189					231					95
CV (%)					8							17						9						11						9

[admin]

Tabelul IV.5: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie) Parametrii de validare														ANALIT
SP				SM				SMP					SCP					SMZ				SD
Recuperarea	Nivel 1				Conc.(μg/kg)			53			49				52			47			66				44
Recuperare (%)			106				99			105						94			132				88
Nivel 2		Conc.(μg/kg)				97			112			128					101			148				100
Recuperare (%)			97				112			128						101			148				100
Nivel 3		Conc.(μg/kg)				139			173			190					148			234				138
Recuperare (%)			93				115			126						99			156				92
Limita de decizie CCα şi capabilitate de detecţie CC β		Conc. medie (μg/kg)				1,19			2,17			1,89					3,81			1,41				0,29
DS			0,09				0,19			0,55						0,48			0,24				0,15
1,64 x DS			0,15				0,31			0,90						0,79			0,39				0,25
CCα (μg/kg)			1,34				2,48			2,79						4,60			1,80				0,54
CC β (μg/kg)			1,49				2,79			3,69						5,39			2,19				0,79

[admin]

Analiza cantitativă a celor 12 sulfonamide studiate în diferite probe de miere

În cercetările efectuate am analizat 11 probe de miere achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la mai mulţi producători din diferite regiuni geografice ale României.

Prelucrarea probelor

Extracţia sulfonamidelor din probele de miere se realizează astfel: în jur de 1g de probă de miere dizolvată în 9 ml tampon de spălare (soluţie de lucru) se menţine la incubat la 37°C timp de 30 minute şi se agită pe un roller pentru 10 minute până la dizolvare. Soluţia probei se diluează cu o cantitate egală de soluţie tampon de spălare şi se aplică pe suprafaţa biocipului.

Din acest mod de lucru rezultă o diluţie a probei de miere de 1:20, de care se va ţine cont la calcul.

Etape de lucru
se execută manual şi sunt similare celor de la tehnica ELISA:

• reactivii şi proba sunt adăugaţi pe un biocip pregătit pentru utilizare

• incubare biocipuri la 37°C cu agitare.

• spălare biocipuri pentru a îndepărta de pe suprafaţa lor orice component care nu s-a legat.

• reactivul semnal este adăugat pe fiecare biocip înainte să aibă loc citirea imaginii în modulul de captare imagine al analizorului Evidence Investigator.

• lumina emisă de fiecare regiune de test este analizată cu ajutorul softului de procesare imagine şi cuantificată rapid în unităţi de măsură RLU (Relative Light Unit) folosind o curbă de calibrare; rezultatele sunt calculate automat de un software dedicat. Intensitatea luminoasă este invers proporţională cu concentraţia analitului.

Rezultate şi discuţii

Pentru confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip, probele de miere au fost testate şi prin metoda LC-MS/MS. Analizele au fost efectuate utilizând sistemul Agilent 1100 LC (



Agilent
Technologies


SUA) cuplat cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA).


Două din probele analizate au fost pozitive în urma determinărilor prin metoda Biocip, având valori mai mari decât 10 μg/kg pentru mai multe sulfonamide analizate cu ajutorul Panelului I Antimicrobian. Majoritatea ţărilor din UE au stabilit limita minimă de performan
tă necesară (LMPN) pentru sulfonamide la valoarea de 10 μg/kg (Michaud, 2005).


Performanţele metodei Biocip au fost bune, valorile obţinute au fost comparabile cu rezultatele metodei confirmatorii atât pentru probele pozitive, cât şi pentru probele negative. Probele pozitive confirmate prin metoda LC-MS/MS sunt prezentate în tabel IV.9.

Concluzii
Tehnologia Biocip aplicată a permis măsurarea simultană şi selectivă a 12 sulfonamide în miere la nivele mult mai mici decât LMR stabilite.

Determinarea cantitativă simultană a celor 12 sulfonamide prezintă specificitate pentru fiecare analit ţintit, iar senbilitatea metodei exprimată ca IC50 este ≤ 2,5 μg/kg.


Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraţiile de 50, 100 şi 150 μg/kg.


Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acurateţe, liniaritate, limite de detecţie şi cuantificare, respectă recomandările Deciziei Comisiei Europene 2002/657/CE şi demonstrează că metoda poate detecta şi cuantifica reziduuri din sulfonamidele amintite fără analiza prin spectrometrie de masă sau derivatizarea fluorescentă a analiţilor.



CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE NITROFURANI ŞI CLORAMFENICOL ÎN MIEREA DE ALBINE


Scopul cercetãrii






În acest capitol ne-am propus validarea metodei de determinare a 4 metaboliţi ai nitrofuranului din mierea de albine şi anume 1-amino-imidazolidin-2,4-dionă (AHD), 3-amino-5-morfolinometil-2-oxazolidinonă (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidonă (AOZ), semicarbazidă (SEM) şi a cloramfenicolului (CAP) utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.


Introducere


Nitrofuranii au fost utilizaţi în practica veterinară ca agenţi antibacterieni, pentru tratarea infecţiilor cauzate de bacterii şi protozoare. Deşi utilizarea lor a fost interzisă pentru prima dată în UE începând cu data de 1 ianuarie 1997 prin anexa IV a Regulamentului



2377/90/CE (Leitner

et al., 2001), la ora actuală se mai folosesc pentru animalele care nu sunt crescute pentru consum.



Numeroase publicaţii menţionează că nitrofuranii sunt utilizaţi în tratarea albinelor pentru producţia de miere, deşi actualmente, conform Regulamentului nr. 37/2010 al Comisiei UE, nitrofuranii sunt substanţe interzise pentru toate animalele producătoare de hrană.


Nitrofuranii utilizaţi în tratamentele albinelor sunt nitrofurantoina, furazolidona, furaltadona şi nitrofurazona. Rezultatele unei determinări simultane a reziduurilor din patru nitrofurani (furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin, şi nitrofurazona), au demonstrat că furazolidonul este principalul chimioterapic antimicrobian administrat în tratarea bolilor bacteriene ale albinelor (Khong
et al., 2004).



Dezvoltarea unor metode accesibile care să permită detectarea lor este de interes pentru programele de monitorizare şi de reglementare a reziduurilor în alimente.


Detectarea reziduurilor de nitrofurani este de obicei realizată cu ajutorul lichid cromatografiei în tandem cu spectrometria de masă (LC-MS/MS) (Leitner
et al., 2001; O’Keeffe et al., 2004). Metoda imunochimică a fost propusă ca o alternativă pentru a detecta reziduurile de nitrofurani în miere.



Cloramfenicolul are acţiune bacteriostatică şi este eficient în tratamentul bolilor infecţioase. Are un spectru de activitate asemănător tetraciclinei, dar utilizarea lui în medicina umană şi veterinară este interzisă datorită efectelor adverse pe care le are asupra organismului uman (Joshi, 2002).

Material şi metodă

Tehnologia Panelurilor Biocip şi aparatura pentru determinarea cantitativă simultană a nitrofuranilor şi cloramfenicolului din miere au fost prezentate în capitolul IV din partea experimentală a tezei de doctorat.


Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi într-un kit compact care include:


Antimicrobial Array III – kit (cod de catalog EV3695, Randox Laboratories, UK).





Antimicrobial Array III Control – kit (cod AMC5036, Randox Laboratories, UK).





Validarea metodei







Parametrii de validare evaluaţ au fost urmăorii:



a) Liniaritatea metodei








Liniaritatea metodei s-a verificat prin efectuarea unei calibrăi î 9 puncte pentru fiecare din cei 4 nitrofurani ş pentru cloramfenicol utilizâd calibratorii incluş î kitul Anti Microbial Array III.


Softul analizorului utilizeazăpentru calibrare o ecuaţe specificăpentru metoda de detecţe imunoenzimaticăcompetitivă(Findlay, Dillard, 2007):


y = D + [(A-D)/1+(x/C)
B]




unde:


x = concentratia analitului (μ/kg),


y = intensitatea semnalului chemiluminescent exprimatăî RLU


A, B, C, D - parametri ai metodei competitive ş sunt predefiniţ î softul analizorului:


A = intensitatea semnalului chemiluminiscent la concentraţa 0 a analitului


B = factorul pantei


C = punctul de inflexiune al curbei de calibrare


D = intensitatea semnalului luminos de răpuns la o concentraţe teoreticăinfinităa analitului.


Î urma determinăilor s-au obţnut coeficienţ de corelaţe (r) mai mari de 0,98, cel mai mic coeficient s-a obţnut î cazul SEM (0,982).


Rezultatele obţnute dovedesc faptul căa fost îdeplinităcondiţa de admisibilitate a curbei de calibrare (coeficienţi de corelaţe admiş trebuie săfie > 0.949).


0,40,090,440,742,3200,511,522,5AHDAOZSEMAMOZCAPIC5 0 (μg/kg)

b) Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)

Concentraţia inhibitorie (IC50) pentru fiecare analit testat s-a calculat luând 50% din valoarea semnalului RLU generat de calibratorul de concentraţie zero şi extrapolând valoarea RLU astfel obţinută pe axa x a curbei de calibrare pe care sunt exprimate unităţile de concentraţie în μg/kg. Concentraţia astfel obţinută corespunde concentraţiei inhibitorii ce produce 50% inhibiţie.

Sensibilitatea metodei exprimată sub formă de IC50 pentru determinarea cantitativă simultană a celor 4 nitrofurani şi a cloramfenicolului a înregistrat valori care au fost ≤ 2,32 μg/kg şi care sunt detaliate în fig. V.8.

Fig. V.8: Valorile sensibilităţii metodei pentru nitrofuranii analizaţi şi cloramfenicol

c) Precizia şi acurateţea

Conform legislaţiei actuale şi ghidurilor de validare pentru metodele de determinare ale reziduurilor medicamentoase din miere, precizia şi acurateţea se evaluează atât pentru concentraţia corespunzătoare limitelor LMPN (1 μg/kg), cât şi pentru concentraţii reprezentând 50 %, respectiv 150 % din LMPN.



Precizia s-a determinat în cadrul aceleiaşi serii analitice şi în serii analitice diferite. Valorile obţinute pentru determinarea preciziei şi acurateţei sunt prezentate în fig. V.9. şi în fig.V.10.

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa" - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine 32




Fig.

V.9: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în



cadrul aceleiaşi serii analitice


Fig. V.10: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în


serii analitice diferite
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa" - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine




33



00,20,40,60,811,2AOZAMOZAHDSEMCAPLimita de decizie CCα (μg/kg)Capabilitatea de





d) Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)






Limita de decizie (CCα) a fost calculată ca fiind media aritmetică a concentraţiei analitului la nivel LMPN plus 1.64 x DS a repetabilităţii la α = 5% (CCα) Capabilitatea de detecţie (CCβ) a fost calculată ca fiind media aritmetică a concetraţiei analitului la nivel CCα plus 1.64 x DS a repetabilităţii la α = 5% (CCα). Valorile obţinute sunt redate în fig. V.11.


Fig. V.11: Limita de decizie (CCα)

şi capabilitatea de detecţie (CCβ)


e) Regăsirea (recuperarea)

Procentul de recuperare s-a calculat pentru 3 nivele de concentraţie reprezentând 50%, 100 % şi 150 % din limita minimă de performanţă necesară pentru reziduurile de nitrofurani şi cloramfenicol în mierea de albine (LMPN = 1 μg/kg). Probele de miere au fost îmbogăţite cu următoarele concentraţii de nitrofurani şi cloramfenicol: 0.5, 1, 1.5 μg/kg. Procentele de recuperare au fost calculate efectuând raportul dintre concentraţia analitului din proba analizată şi concentraţia teoretică a analitului din soluţia standard.


AOZ AMOZ AHD SEM CAP Conc. (μg/kg) Recuperare (%) 124 124 136 192 64 0,62 0,62 0,68 0,96 0,32 0 50 100 150 200 Procentul de recuperare - Nivel 1 (0,50 μg/kg) n = 20


AOZ AMOZ AHD SEM CAP Conc. (μg/kg) Recuperare (%) 106 111 119 125 75 1,06 1,11 1,19 1,25 0,75 0 20 40 60 80 100 120 140 Procentul de recuperare - Nivel 2 (1 μg/kg) n = 20



Procentele de recuperare obţinute sunt prezentate în fig.V.12- V.14.


Fig.V.12: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care reprezintă 50 % din LMPN


Fig. V.13: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care reprezintă 100 % din LMPN



albine


35


AOZAMOZAHDSEMCAPConc. (μg/kg)Recuperare (%)123115121150711,841,731,812,251,06050100150Nive l 3 (1,5 μg/kg)n = 20




Fig.V.14: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care reprezintă 150 % din LMPN



Analiza cantitativă a celor 4 metaboliţi de nitrofuran şi a cloramfenicolului în diferite probe de miere







Metoda validată a fost aplicată la determinarea a 11 probe de miere achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la producători din diferite regiuni geografice ale României în perioada mai - august 2011.



Prelucrarea probelor







Derivatizarea şi extracţia nitrofuranilor şi cloramfenicolului din probele de miere s-a realizat astfel:


▪ mase de probă în jur de 1g de probă de miere dizolvate în 4 ml apă distilată se incubează la 37°C timp de 30 minute şi se agită pe un agitator pentru 10 minute până la dizolvare.


▪ peste soluţia probei se adaugă mai întâi 0,5 ml soluţie HCl 1M şi apoi 100 μl soluţie 10mM 4-nitrobenzaldehidă. Se omogenizează amestecul, se agită pe un agitator pentru 10 minute şi apoi se incubează timp de 16 – 24 ore la 37°C.


după incubare, în fiecare probă se adaugă 5 ml soluţie fosfat dipotasic (0.1M K
2HPO4·3H2O). Se corectează pH-ul soluţiei obţinute la valoarea de 7,4 cu soluţie NaOH 1M.

▪ peste această soluţie se adaugă acetat de etil (15 ml acetat de etil la 5ml proba miere derivatizată). După agitare cu ajutorul agitatorului Vortex timp de 2 minute, urmează omogenizarea timp de 10 minute şi centrifugarea probei 10 min la 4500 rcf.

▪ din supernatant se transferă în microtuburi câte 6 ml din fiecare probă. Microtuburile cu probe se evaporă pentru 30 min la 60°C şi presiune 15 psi.

▪ reziduul obţinut după evaporare se reia cu 375 μl diluant pentru probe (AM III DIL SPE) şi se agită cu ajutorul agitatorului Vortex timp de 2 minute.

Etape de lucru
se execută manual şi sunt similare celor de la tehnica ELISA:

Rezultate şi discuţii

Confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip pentru probele de miere analizate s-a realizat prin metoda LC-MS/MS, utilizând sistemul Agilent 1100 LC (
Agilent Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA).

Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi reziduuri medicamentoase la valori peste LMPN. În proba 3 s-au determinat concentraţii de nitrofurani (SEM şi AOZ) peste valoarea de 1 μg/kg (LMPN), valorile obţinute prin metoda Biocip fiind comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-MS/MS (tabel V.4).

[admin]

Tabelul V.4: Concentraţiile celor 4 nitrofurani şi cloramfenicol determinate prin metoda Biocip şi LC-MS/MS Proba					Metoda						Concentraţie analit (μg/kg)
AOZ			AMOZ			AHD				SEM			CAP
Proba 1	Biocip			0,50			0,74		0,46			0,75			0,79
LC-MS/MS		0,17			0,12			0,32			0,19			0,88
Proba 2	Biocip			0,76			0,75		0,78			0,66			0,84
LC-MS/MS		0,41			0,42			0,13			0,28			0,33
Proba 3	Biocip			1,24			2,88		4,16			7,21			3,07
LC-MS/MS		1,11			1,46			2,34			6,54			2,34
Proba 4	Biocip			0,68			0,53		0,55			0,54			0,23
LC-MS/MS		0,08			0,34			0,11			0,38			0,07
Proba 5	Biocip			0,35			0,65		0,73			0,44			0,76
LC-MS/MS		0,12			0,18			0,65			0,22			0,61
Proba 6	Biocip			0,44			0,88		0,67			0,57			0,49
LC-MS/MS		0,43			0,65			0,60			0,52			0,29
Proba 7	Biocip			0,41			0,54		0,65			0,72			0,77
LC-MS/MS		0,09			0,16			0,45			0,43			0,43
Proba 8	Biocip			0,28			0,78		0,89			0,34			0,44
LC-MS/MS		0,22			0,98			0,99			0,21			0,94
Proba 9	Biocip			0,27			0,99		0,54			0,88			0,11
LC-MS/MS		0,07			0,76			0,76			0,72			0,32
Proba 10	Biocip			1,07			0,99		1,14			0,88			0,11
LC-MS/MS		0,72			0,77			0,76			0,72			0,32
Proba 11	Biocip			0,43			0,43		0,54			0,88			0,11
LC-MS/MS		0,44			0,76			0,76			0,72			0,32
Proba 12	Biocip			0,76			0,65		0,42			0,63			0,85
LC-MS/MS		0,42			0,48			0,53			0,26			0,12

[admin]

Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele existente în literatura de specialitate.

Concluzii

Tehnologia Biocip a permis măsurarea simultană şi selectivă a 4 metaboliţi de nitrofurani şi a cloramfenicolului în miere la nivele mult mai mici decât LMPN admise.

Metoda aplicată se caracterizează prin specificitate pentru fiecare analit ţintit şi prin sensibilitate exprimată ca IC50, care a înregistrat valori ≤ 2,32 μg/kg.

Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraţiile de 0,5, 1 şi 1,5 μg/kg. Limita de decizie (CCα) obţinută pentru determinarea metaboliţilor a 4 nitrofurani şi cloramfenicolului s-a încadrat între valorile 0,37 μg/kg şi 1,05 μg/kg. Capabilitatea de detecţie (CCβ) a înregistrat valori care s-au încadrat în intervalul 0,42 - 1,14 μg/kg. Coeficientul de recuperare obţinut s-a situat în domeniul 64 – 192 % faţă de concentraţia iniţială.